Pewarnaan Pada Mikroba

             Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberap macam. Pada bentuk basil, pembagiannya meliputi basil tunggal, diplobasil, dan triptobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus ( satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (berbentuk mirip buah anggur). Khusus pada spirilum hanya terbagi menjadi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung.

               Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah atau ungu. Bakteri gram negative ditandai dengan pewarnaan ungu, sedangkan yang positif berwarna merah. (Anonymous, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang yang bias diwarnai. Endospore adalah organism yang dibentuk dalam kondisi yang stress karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut dilingkungan sampai kondisi mnjadi baik (Nobi, 2008) teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahn identifikasi data apakah gram positif atau gram negative, sehingga diperlukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaanya.
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Tryana, 2008)

           Struktur dasr bakteri terbagi menjadi dua, yaitu:
1.      Struktur dasar (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu), meliputi: dinding sel, membrane plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan.
2.      Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu), meliputi kapsul, flagellum, pilus, fimbria, klorosom, vakuola, gas, dan endospora.

            Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangatlah sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengamati hal tersebut maka dikembangkansuatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitisn mikrobiologi. (Rizki, 2008)

          Macam-macam pewarnaan
1.      Pewarnaan negative
Bakteri tidak diwarnai tapi mewarnai latar belakang
Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarna seperti spirochaeta
2.      Pewarnaan sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru methilen atau air fukhsin)
Bertujuan hanya untuk melihat bentuk sel.
3.      Pewarnaan differensial
Menggunakan lebih dari satu macam zat wrna
Tujuan untuk membedakan antar baktericontoh pewrnaan gram, perwarnaan bakteri tahan asam.
4.      Pewarnaan khusus
5.      Untuk mewarnai struktur khusus / tertentu dari bakteri menjadi kapsul dan spora. Serta flagell.

Cara Pewarnaan Negative

        Sediaan dihapus kemudian teteskan emrsi, kemudian lihat dimikroskop
Untuk mempelajari morfologi, struktur, sifat-sifat bakteri dalam membantu mengidentifikasi, kuman perlu diwarnai. Pewarnaan gram adalh suatu metode empiris untuk membebaskan spesies bakteri menjadi 2 kelompok besra, yakni gram positif, dan gram negative. Berdasrkan sifat kimia dan fisikanya dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark, Hant Cristian Gram (153-1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1984 untuk membedakan antara pneomokokus dan bakteriislebsiella pneumonia (fizahazny, 2008)

          Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak dapat mempertahankan zat warna metal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metal ungu gelap. Setelah dicuci dengan alkool, sementara bakteri gram negatifnya tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna menimbal di tambahkan setelah metal ungu yang membuat semua bakteri gram negative, menjadi berwrna merah, atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tip bakteri ini berdasarkan perbedaan  struktur dinding sel mereka (Fizahazny, 2008)
Pewarnaan sederhana

             Adalah pewarnaan yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis pewarnaan untuk mewarnai organism. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana, karena sitoplasma bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang akan digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromatofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, villario, basillus, dll), dan bahan-baha lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai (hadiutomo, 1990)
Pewarnaan negative, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri, tapi mewarnai latarbelakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel.

Cirri-ciri gram negative:
         Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer
         Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapt dalam  lapisan kaku,, sebelh dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam laktat.
         Kurag rentan terhadap senyawa penisilin.
         Tidak resisten terhadap gangguan fisik

Ciri-ciri bakteri gram positif:
         Struktur dindingnya tebal
         Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
         Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
         Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal
         Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
         Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu
a.       Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu
b.      Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan
c.       Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam
d.      Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

          Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan gram untuk:
Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar
Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme
Membantu mengidentifikasi atau membedakan organism yang serupa ( Suriawieia, 2002).

3.1 Cara Kerja
3.1.1 alat                                   3.1.2 Bahan
         Mikroskop                                           aquades sterl
         Kaca benda                                         biakan murni bakteri
         Mangkuk pewarna                              Alkohol 70%
         Kawat penyangga                               Larutan iodin
         Pipet                                                    Kristal violet
         Pinset                                                  Larutan Safranin
         Lampu spirtus                                     Alkohol 95%
         Botol penyemprot

3.2 Cara Kerja
a. Menyediakan kaca benda yang bersih, lalu lewtkan diatas nyala api lampu spirtus
b. Meneteskan setetes aquades steril diatas kaca benda tersebut
c. Secara aseptic ambillah inokulum bakteri yang akan diperiksa, lalu letakkan diatas tekanan aquades itu. Kemudian ratakan perlahan-lahan.
d. Mengambil kaca benda lain yang bersih, lalu meletakkan diatas kaca benda sediaan sehingga membentuk sudut 45⁰
e. Menggeserkan kaca benda yang tegak ini, sehingga sediaan menjadi tipis dan merata. Biarkan sampai kering.
f. melakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan tersebut diatas nyala api lampu spirtus dengan cepat.
g. Meletakkan sediaan diatas kawat penyangga yang berada diatas mangkuk pewarna. Lalu meneteskan Kristal violet diatas sediaan tersebut. Menunggu sampai 1 menit.
h. Mmembuang kelebihan zat warna tersebut kedalam mangkuk dan bilaslah sediaan dengan air kran
i. Meneteskan larutan iodine diats sediaan itu, lalu menunggu selama 2 menitdengan air kran.
k. Membuang alcohol 95% diatas sediaan, lalu membiarkan selama 1 menit.
l. Membuang sisa alcohol kedalam mangkuk dan membilas sedian dengan air kran.
m. Meneteskan larutan safranin diatas sediaan , lalu membiarkannya selama 30 detik.
n. Membuang kelebihan larutan safranin kedalam mangkuk, lalu bilas dengan air kran.
o. Mengeringkan sediaan itu secara hati-hati dengan kertas  penghisap lalu periksalah dibawah mikroskop. Bila teknik pewarnaannya berhasil dengan baik, maka sel-selnya bakteri yang bersifat gram positif akan berwarna ungu, sedangkan sel-sel bakteri yang bersifat gram negative akan berwarna merah dan merah muda.

        Dibawah ini merupakan gambar dari pewarnaan bakteri gram positif





               Pewarnaan bakteri untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras antara sel dan latar belakang, sehingga dapat mempertajam bentuk sel-sel mikroba itu sendiri, dengan car mewarnai sel-sel mikroba dengan zat warna khususnya, yaitu warna Kristal violet pada pengecatan digunakan bakteri Bacillus aereus dan Salmonella typii. Setelah pengecatan diperoleh bakteri tersebut berwarna ungu, yamg berarti bakteri tersebut menyerap zat warna cat tersebut sehingga Nampak pada mikroskop. Zat wwarna yang umumnya digunakan adalah bersifat alkalin (Anonymous. 2008)
Langkang-langkah dalam pewarnaan gram







           Pengamatan gram termasuk pengecatan differensial yang digunakan untuk membedakan bakteri garam positif atau bakteri gggram negate. Pada pengecatan ini digunakan 3 jenis bakteri, yaitu: Bacillus aerus, salmonella typii, dan Eschercia colli. Pengecatan ini menggumakan 4 jenis larutan, yaitu: Kristal violet sebagai catwarna, larutan iodin sebagi pengintensifan cat utama, alcohol asam untuk pencucian dan safranin sebagai zat penetup. Berdasarkan percobaan dapat Baccilus aerus, dan Salmonella typii bersifat gram positif yang berartibakteri dapat mengikat dengan kuat cat warna ungu dari Kristal violet. Pada saat gram positif ditambahkan dengan kristel violet, maka gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding sel. Dengan pemberian larutan iodin mak Kristal violet akan masuk sampai ke inti sel. Pemberian alcohol menyebabkan pori-pori di dalam sel disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid. Pada praktikum yang telah dilakukan dapat juga diidentifikasi bahwa bakteri berbentuk basil dan memiliki bidang pandang mikroskopis. Bakteri ini ditemukan pada perbesaran 40×10 (Anonymous, 2010)
         Pewarnaan bakteri digunakan untuk memperlihatkan atau mempelajari kontras antar sel dan latar belakangnya sehingga dapat mempertsjsm bentuk sel-sel mikroba.
         Pengecatan gram termasuk pengecatan differensial yang digunakan untuk membedakan gram positif dan gram negative.
         Pada pengecatan, digunakan 4 larutan, yaitu: Kristal violet, iodine, alcohol. Dan safranin
         Bakteri yang bersifat gram positif dapat mengikat dengan kuat ungu dari krostal violet, sedangkan bakteri yang bersifat gram negative tidak dapat mengikat warna ungu dari Kristal violet biasa akan berwarna merah atau merah muda setelah diamati pad mikoskop.

Posted in: Mikrobiologi